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動物實驗

本實驗目的旨在比較牙周韌帶細胞(PF)或牙齦細胞(GF)添加冷凍乾燥脫鈣骨(DFDBA)後之細胞移植與單獨使用DFDBA移植之治療效果,以及兩種細胞添加DFDBA前後之細胞生物特性。

本實驗由中興大學獸醫學院提供2隻2至3歲健康、無缺牙的中型長嘴型狗,取其下顎側門牙之牙周韌帶和牙齦組織進行體外細胞培養,將5*105 cells置入60mm的培養皿中,3天後將約45顆DFDBA(Pacific Coast)置入,再14天後,待細胞佈滿在DFDBA上時,即可植入狗牙床中。

本實驗分為實驗組及對照組

  1. 實驗組:牙齦或牙周韌帶細胞添加DFDBA
  2. 對照組:單獨使用DFDBA。

右側下顎第三小臼齒及第一大臼齒處為PF+DFDBA,對稱左側處則為GF+DFDBA,另兩側下顎第二小臼齒皆為DFDBA。狗於全身麻醉條件下進行牙周翻瓣手術,人為破壞齒槽骨缺損約6*3mm2,並以2mm round bur鑽孔,再將添加細胞的DFDBA或單獨DFDBA植入齒槽骨缺損處後再縫合。癒合期三個月期間,間隔1個月於狗背部皮下施打螢光劑Calcein (20mg/Kg,Sigma)標誌,並分析術前與術後1、2、3個月X-ray照射及臨床測量牙齦萎縮量,三個月後選擇下顎第一大臼齒以reentry方式,觀察牙周組織恢復之情形,其他部位牙齒即以組織切片方式,利用H&E、TB stain及螢光標定觀察齒槽骨缺損處之傷口愈合情形。同時於體外分析牙周韌帶及牙齦纖維母細胞之生物特性,其方法

  1. 以ALPase活性(Alkine phosphatase, ALPase)為指標測量細胞鈣化潛力與DFDBA之誘導牙周細胞鈣化效應
  2. 測定細胞生長速率,將5×104個細胞置入60mm的培養皿中,分別於第1、3、5、7、9、11、13、15、17、20天計算細胞數目,再比較各組細胞之doubling time及細胞最高生長密度。

自體細胞移植手術過程圖解(IN Vivo)
以人為方式破壞牙周骨,造成骨缺損(Boue defat)約 6x3mm2之面積並於缺損部位中央以2mm round bur 於牙根鑽孔

植入位置選擇
實驗組Cell+DFDBA 對照組DFDBA:於右下顎小臼齒近心頰側(p44 mesial buccal side)進行自體細胞移植(PF+DFDBA)手術後縫合(左側GF+DFDBA)

結果
三個月後臨床結果觀察,術後兩組牙齦萎縮量約為1-2mm,並無統計上差異,牙周組織恢復良好,無明顯發炎反應。由X-ray上判讀,兩組於術後第三個月均有明顯骨質形成現象。從組織切片中觀察H&E、TB stain與螢光標誌,兩組皆能顯著恢復齒槽骨高度,但在2mm round bur鑽孔破壞之凹陷面積處之骨質形成量,實驗組顯示較優勢的骨質形成量(75%:20%)。在H&E、TB stain觀察下可以清楚判定,單獨DFDBA移植僅有新生骨形成,而在細胞加DFDBA處可以發現新形成骨質外,亦新形成牙骨質和牙周韌帶之再生現象。在螢光標誌方面,清晰看見兩組皆有新骨質形成之螢光表現,且僅在實驗組的鑽孔破壞凹陷處可清楚表現三條線狀之螢光,可證明其為新形成之牙骨質。

比較兩組細胞之生長速率(Doubling time /hr),其結果為PF(84hrs)快於GF(112.8hrs);最高生長密度(cells/ 60mm dish)分別為PF(6.84*105)、GF(4.72*105);在鹼性磷酸酶(ALPase)活性方面GF活性(1.62± 0.25)顯著低於PF(6.04±0.6),但在DFDBA誘導下於第八天誘導活性,GF增加約四倍(5.72±0.74),其活性和PF添加DFDBA相近(5.27±0.65)。

故由以上結果可以證明兩組移植方法都可以修復骨缺損,而僅使用牙周韌帶細胞或牙齦纖維細胞添加DFDBA之細胞移植可以達到再生現象,同時也發現DFDBA可以增強牙周韌帶及牙齦纖維細胞ALPase的表現能力,至於是否與鈣化能力有關仍待進一步研究。